Nykyisten kertomusten mukaan James oli ollut huonovointinen useita kuukausia ennen kuolemaansa, ja hänellä oli erilaisia oireita, kuten rintakipua, hengenahdistusta ja ruoansulatusongelmia. Hän oli myös kokenut vaihtelevan käytöksen ja masennuksen aikoja. 21. maaliskuuta 1625 James sai vakavan aivohalvauksen, jonka seurauksena hän halvaantui kehon vasemmalla puolella. Hän ei kyennyt puhumaan tai liikkumaan, ja hänen tilansa huononi nopeasti.
James kuoli kuusi päivää myöhemmin perheensä ja neuvonantajiensa ympäröimänä. Hänet haudattiin Westminster Abbeyyn 5. huhtikuuta 1625. Hänen poikansa Kaarle I seurasi häntä valtaistuimelle.
Vaikka tarkkaa kuolinsyytä ei tunneta, uskotaan, että Jamesin kuolemaan vaikutti useiden tekijöiden yhdistelmä, mukaan lukien hänen terveydentilan heikkeneminen, aivohalvaus ja kolmannen asteen sairaus. Jotkut nykyajan kertomukset viittaavat myös siihen, että James on saatettu myrkytetty, mutta tämän väitteen tueksi ei ole konkreettista näyttöä.